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    本發明提供一種在疑似腎臟疾病或腫瘤疾病的個體診斷腎臟疾病或腫瘤疾病可能性的方法，包括測定疑似腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的生物樣品中delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的值，比較該測定的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)值與沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的參考值，基於該測定的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)值與delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的參考值的比較診斷腎臟疾病或腫瘤疾病的可能性；其中當疑似腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的生物樣品中delta O-18(δ18O)和/或delta H-2δ2H)的值低於沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的參考值時，則診斷為有腎臟疾病或腫瘤疾病的可能性。本發明亦提供一種實施本發明方法的套組。
    公开号:TW201311276A
    申请号:TW101133083
    申请日:2012-09-10
    公开日:2013-03-16
    发明作者:Hsien-Shou Kuo；Yuan-Hau Lin
    申请人:Hsien-Shou Kuo；Yuan-Hau Lin；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    以生物樣品中氧及氫同位素診斷腎臟疾病或腫瘤疾病
    本發明係關於腎臟疾病或腫瘤疾病的診斷。特定言之，本發明使用生物樣品中的δH-2(δ2H)及/或δO-18(δ18O)值作為腎臟疾病或腫瘤疾病的診斷基礎。
    腎臟為位於脊椎動物腹腔的背側的1或成對的器官，其功能為維持適當的水及電解質平衡、調節酸鹼濃度及過濾血中代謝廢物並以尿液形式排出。因此，腎臟疾病的結果會導致生物整體不平衡。許多器官，如膀胱、腸、心臟、肺及前列腺依靠腎臟的能力濾出身體中的不欲廢物並維持整體平衡。
    腎臟是清潔血液的器官。腎動脈將血液自心臟帶到腎臟，並藉數百萬含有腎元的腎小球網絡清潔血液。腎元濾出毒素、過量營養物及體液；剩餘的經清潔及過濾的血液接著通過腎靜脈回到血液循環中。濾出的物質流經腎小管調整鹽份、水及廢物，並排出至尿液。腎盂收集尿液；尿液從腎盂經輸尿管流到膀胱；尿液排出膀胱並經尿道排出身體。
    腎臟疾病包括高血壓、腎小球腎炎與囊腫。糖尿病影響身體調節血糖的能力，過量血糖會傷害腎臟腎元，降低血管過濾毒素的能力。高血壓傷害腎元；而腎小球腎炎通常關於一類非腎臟感染的疾病。
    如兩個腎由於疾病喪失功能，病患經驗末期腎失調(end stage renal disease；ESRD)或腎衰竭。腎衰竭意指身體不再去除特定毒素且無法適當地調節血壓及重要營養物。除非彼等病患經過治療，否則他們由於毒素及廢液堆積在寫一中而可能在數天內死亡。
    糖尿病性腎病，已知為糖尿病腎病變，是第1型糖尿病(TIDM)患加速發病並提早死亡。約25%至40%的TIDM病患會發展成糖尿病腎病變。糖尿病腎病變的最長期嚴重影響是腎衰竭導致末期腎臟病，一種永久及幾乎完全失去腎功能的病況，僅有少於10%的腎基礎功能。
    已知診斷腎臟疾病的傳統方法牽涉特定蛋白質的檢測。US7,141,382關於檢測樣品中介白素18(interleukin 18)的方法，較佳為傾向如腎衰竭的個體的血清肌酸酐增加前。US7,935,495提供一種檢測動物早期腎病的方法，包括下列步驟：(a)得到欲檢測樣品及(b)測定樣品中白蛋白的量。US7,833,872關於新穎且有用的生物標記，GRO-alpha(即，CXCL1、趨化素(Chemokine)C-X-C配體1、GRO1、GROa、MGSA、MGSA alpha、MGSA-a、NAP-3、SCYB1)，針對急性腎傷害(即AKI)、腎缺血再灌注傷害(即IRI)、缺血性急性腎傷害及/或缺血性急性腎小管性腎炎。雖然已知許多測定尿液或血液樣品中成份的診斷腎失調的方法，但此等方法的缺點是牽涉複雜的步驟以得到測定結果。
    此外，腫瘤或癌症病況持續為最普遍引起死亡的疾病的一種疾病。腫瘤發生隨老化增加。腫瘤或癌症由持續多種基因突變引起，導致致癌基因活化和/或腫瘤抑制基因不活化。腫瘤或癌症成為全球致死率的主要原因。雖然診斷及治療的進步，總存活率並未顯著提升。仍有需要較準確和靈敏的診斷腫瘤或癌症的檢測方法，特別是早期階段的腫瘤或癌症。
    水是生命的基礎，也是身體最重要且最豐富的物質，約占身體質量的70%。雖然注意到水的重要性，但水同位素的獨特性通常被忽略。天然水含有微量的重同位素氫和氧原子，其中2H與18O是主要種類。1H對2H的比例約為6240比1，或在V-SMOW(Vienna Standard Mean Ocean Water)水標準中為約155ppm，和16O對18O的比例約為499比1或約2005 ppm。水同位素的獨特特性與質譜技術的快速進展，各種生物樣品中氫(δH)與氧(δO)的安定比例已在古食物、氣象學、人類學、生態學和現代食物鏈網中作為「原子化石或追蹤者」。
    安定的非放射活性的同位素水，2H2O，在人類生理和病理生理上扮演重要角色。數種使用動物和細胞培養研究已顯示飲食水中2H2O的增加或缺乏在病理生理和生理上具有重要影響。例如，先前顯示2H2O藉由刺激微管蛋白次單元(tubulin subunit)的聚合可促進微小管(microtubule)的形成，並導致細胞死亡。此外，2H2O含量增加在自發性高血壓鼠可預防高血壓。換言之，培養基中水的重氫(deuterium)缺乏降低動物細胞株的生長率。未治療的鏈佐黴素誘導的糖尿病(streptozotocin-induced diabetes mellitus)鼠的身體水中的氫(δ2H)與氧(δ18O)同位素比例與正常鼠顯著不同。
    然而，沒有任何前案揭示、教示或建議水同位素與腎臟疾病與腫瘤間的關係。
    本發明驚訝地發現生物樣品中delta H-2(δ2H)和/或delta O-18(δ18O)的值與腎臟疾病或腫瘤疾病有關。因此，本發明發展比較得自假定具有腎臟疾病可能的個體與沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的生物樣品中delta H-2(δ2H)和/或delta O-18(δ18O)的診斷腎臟疾病或腫瘤疾病的方法。
    除非另有定義，本文中所有技術或科學用語具有技藝人是一般了解的意義。所有本文中提到的公開刊物、專利申請案、專利及其他參考資料均以其全文併入參考。此外，材料、方法及實施例僅做為說明，並非限制本發明。
    用語「檢測(detecting)」或「診斷(diagnosing)」係鑑定具腎臟疾病或腫瘤疾病的病患或罹患腎臟疾病或腫瘤疾病風險的病患。
    用語「分析(assay)」指分析樣品以測定樣品中物質的存在和/或該物質的量。
    用語「降低量(decreased amount)」指較預定量為低的量。用語「腎臟疾病(renal disease)」指一個體的腎臟功能失調、受損、異常或功能障礙。
    用語「樣品」指得自哺乳動物個體的體液或組織液樣品。作為非限制性實例，用於本發明的體液或組織液樣品可為尿液、血液、血清、血漿、唾液、淋巴液、腦脊髓液、囊性液(cystic fluid)、腹水、糞便、膽汁、組織液及任何其他的分離體液。
    用語「腫瘤」或「癌症」包括，但不限於，源自乳房、前列腺、大腸、肺、胰臟、肝、胃、膀胱或生殖器官(子宮頸、卵巢、子宮內膜等)、腦和骨髓的腫瘤或癌症、黑色素瘤或淋巴癌。
    本案引用的所有刊物與專利文件以其全部併入參考，其目的是如個別公開或專利文件指出的相同範圍。文件中的各種參考資料的引用，申請人不承認任何特定文獻為其發明的先前技術。
    在一方面，本發明提供一種在疑似腎臟疾病或腫瘤疾病的個體診斷腎臟疾病或腫瘤疾病可能性的方法，包括測定疑似腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的生物樣品中delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的值，比較該測定的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)值與沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的參考值，基於該測定的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)值與delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的參考值的比較診斷腎臟疾病或腫瘤疾病的可能性；其中當疑似腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的生物樣品中delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的值低於沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的參考值時，則診斷為有腎臟疾病或腫瘤疾病的可能性。
    所有哺乳動物個體可使用本發明方法測試。典型地，受測個體(或病患)罹患腎功能障礙(例如末期腎失調、腎病變、腎衰竭、高尿酸血症、糖尿病性腎病變、缺血性或毒物誘導的腎傷害、慢性腎衰竭、急性腎衰竭、腎小球性腎炎、多囊性腎病或慢性腎盂腎炎)、或腫瘤(例如，贅瘤(neoplasm)、腫瘤(tumor)、癌瘤(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、腺瘤(adenoma)、骨髓白血病、肝細胞癌、肝母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、食管癌、甲狀腺癌、神經節母細胞瘤、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏瘤(ewing's sarcoma)、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、大腸癌、胰臟癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、腎細胞癌、血腫、膽管癌、黑色素瘤、絨毛膜癌、精母細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果腺瘤、血管母細胞瘤、視網膜母細胞腫瘤、白血病、急性成髓細胞性白血病、慢性白血病、真性紅細胞增多症、淋巴瘤(何傑金氏症及非何傑金氏症)、多發性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、直腸癌、頭頸癌、腦癌、原發部位未明癌、周圍神經系統癌、中樞神經系統癌、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、重鏈病、癌轉移、及以未控制或不正常細胞生長表徵的任何疾病或病症組成的群組)。較佳地，哺乳動物個體為人類、豬、馬、狗、綿羊、牛、山羊或貓。
    本發明驚訝地發現健康個體的水同位素存在生物平衡(biological homeostasis)。健康個體中的水狀態(δ18O與δ2H)與腎臟疾病或腫瘤疾病的體中的水狀態顯著不同。腎臟疾病或腫瘤疾病的體中的delta O-18和/或delta H-2是降低的。
    樣品中的delta O-18和/或delta H-2的值作為比較用的參考值者是得自沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體(健康病患)。腎臟疾病或腫瘤疾病可藉由得自個體(如疑似罹患腎臟疾病或腫瘤疾病的個體)的體液樣品中delta O-18和/或delta H-2的值降低而診斷。
    根據本發明的方法也適合於健康個體的例行分析，即實施年度分析以診斷非常早期階段的腎臟疾病或腫瘤疾病。
    「控制組」參考值為得自健康狀態的相同或其他個體的參考值。特定言之，同位素表示為關於國際V-SNOW(Vienna Standard Mean ocean Water)標準的δ-符號()。根據本發明，沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta O-18為-3至約-4.5。沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta H-2為-30至約-35。
    根據本發明，水同位素降低診斷為腎臟疾病或腫瘤疾病。也就是說，罹患腎臟疾病或腫瘤疾病的個體中的delta O-18和/或delta H-2的值低於沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體中的值。根據本發明，罹患腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta O-18值低於約-4.5、約-5.5、約-6.0、約-7.0、約-8.0、約-9.0、約-10.0、約-11.0、約-12.0、約-13.0、約-14.0、約-15.0、約-16.0、約-17.0、約-18.0、約-19.0、約-20.0、約-21.0、約-22.0、約-23.0、約-24.0、約-25.0、約-26.0、約-27.0、約-28.0、約-29.0或約-30.0。較佳地，delta O-18值約-4.5至約-30.0；較佳為-4.5至約-25.0、-4.5至約-22.0、-4.5至約-20.0、-4.5至約-18.0、-4.5至約-16.0、-4.5至約-14.0、-4.5至約-12.0、-4.5至約-10.0；更佳為腎臟疾病為-5.0至約-16.0、-5.0至約-14.0、-5.0至約-12.0或更佳為腫瘤疾病為-5.0至約-25.0、-5.0至約-22.0、-5.0至約-20.0、-5.0至約-18.0、-5.0至約-16.0、-5.0至約-14.0、-5.0至約-12.0、-5.0至約-10.0。更佳地，delta O-18值為約-5.0至約-28.0、-5.0至約-26.0、-5.0至約-25.0、-5.0至約-20.0、-5.0至約-18.0、-5.0至約-16.0、-5.0至約-14.0、-5.0至約-12.0或-5.0至約-10.0。
    根據本發明，罹患腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta H-2值低於約-35、約-36、約-37、約-38、約-39、約-40、約-42、約-44、約-48、約-50、約-55、約-60、約-65、約-70、約-75、約-80、約-85、約-90、約-95或約-100。較佳地，delta H-2值為約-35至約-100、約-35至約-95、約-35至約-90、約-35至約-85、約-35至約-80、約-35至約-75、約-35至約-70、約-35至約-65、約-35至約-60、約-35至約-55、約-35至約-50、約-35至約-45、約-35至約-40、約-40至約-100、約-40至約-90、約-40至約-85、約-40至約-80、約-40至約-75、約-40至約-70或約-40至約-65。較佳地，腎臟疾病的delta H-2值為約-40至約-80、約-40至約-75、約-40至約-80、約-40至約-75、約-40至約-70、約-40至約-65、約-40至約-60、約-40至約-55或約-40至約-50。較佳地，腫瘤疾病的delta H-2值為約-45至約-100、約-45至約-95、約-45至約-90、約-45至約-85、約-45至約-80、約-45至約-70或約-45至約-60。
    根據本發明，生物樣品為體液。較佳地，體液為尿液、血液、血清、血漿、唾液、淋巴液、腦脊髓液、囊性液(cystic fluid)、腹水、糞便、膽汁、組織液及任何其他的分離體液。任何已知得到作為同位素測定的水的方法均可用於本發明。根據本發明之一具體實施例，測定同位素的水是得自將體液樣品置於含乾燥劑的密閉容器使得樣品中的水被乾燥劑吸收以得到不含其他成份的純水，並接著從含水(或水合)的乾燥劑去除水分。較佳地，以蒸餾自含水(或水合)乾燥劑去除水；較佳為真空蒸餾。根據本發明，乾燥劑係選自矽膠(silica gel)、活性碳、硫酸鈣、氯化鈣、蒙脫黏土(montmorillonite clay)和分子篩(molecular sieve)之群組。根據本發明之另一具體實施例，用於測定同位素的水是經逆滲透(reverse osmosis)得到。
    在另一方面，本發明係關於實施本發明的套組，該套組包括：一包含生物樣品的容器或預定充填該樣品的容器，該生物樣品得自可能罹患腎臟疾病或腫瘤疾病的個體或罹患腎臟疾病或腫瘤疾病風險的個體，一測定生物樣品中delta O-18和/或delta H-2的裝置，和一參考值裝置，用於診斷腎臟疾病或腫瘤疾病。較佳地，該套組另包含含有乾燥劑的容器。較佳地，該套組另包含自樣品得到其中的水的裝置；例如，含乾燥劑的密閉容器及蒸餾裝置或逆滲透裝置。
    測定delta O-18和/或delta H-2的裝置可選自提供/定量delta O-18和/或delta H-2的任何適合裝置；例如，同位素質譜儀(Isotope-ratio mass spectrometry；IRMS)。
    用於診斷腎臟疾病或腫瘤疾病的參考值的裝置較佳選自得自含健康個體生物樣品的容器。本發明套組可進一步包含校正曲線、套組使用說明書或其組合。較佳包含適當的說明書(如書面形式)，提供關於診斷腎臟疾病或腫瘤疾病的使用資訊。
    本發明研究生物樣品中氫(δ2H)和氧(δ18O)的安定同位素比例，觀察到生物樣品中(如血液、血漿)的δ2H及δ18O與腎臟功能和腫瘤疾病有關。特別是，控制組個體及糖尿病組個體(沒有腎功能障礙)血漿(blood plasma)中的δ18O較晚期腎失調個體分別高87%及160%。健康腎組個體(即控制組個體及糖尿病組個體)血漿(blood plasma)中的δ2H較腎失調組個體分別高72%及92%。然而，在控制組個體和糖尿病組個體血漿中的水含量(δ2H)及氧(δ18O)則沒有差異。 實例
    雖然已參考特定實施例描述本發明，但熟習此項技術者應瞭解，在不悖離本發明之範疇的情況下可作出各種變化且可用等效物替代其元件以適於特定情況。提供以下實驗性實例以展示及進一步說明本發明之某些實施例的各種態樣且不應理解為限制其範疇。在以下實驗性揭示內容中，使用下列材料及方法：參與者. 根據針對參與者之記錄的生物化學參數及醫生描述，將參與者分成三類：對照個體(CS)、診斷為末期腎臟失調(ESRD)之患者及患有糖尿病但無可偵測之腎臟功能障礙(DB)的個體。所有DB個體皆處於糖尿病控制下。所有48名個體(5個CS、32個ESRD及5個DB)皆為居住在臺北市的本地臺灣人。其在取樣日期之前至少三個月未遠足。因此，吾人可消除由食物及水之地理同位素組成而造成的同位素比變化(Bowen GJ,Wilkinson B(2002)Spatial distribution of delta 0-18 in meteoric precipitation. Geology 30：315-318；Hobson KA,Atwell L,Wassenaar LI(1999) Influence of drinking water and diet on the stable-hydrogen isotope ratios of animal tissue,.Proc Natl Acad Sci USA 96：8003-8006；Bowen GJ,Ehleringer JR,Chesson LA,Thompson AH,Podlesak DW等人(2009)Dietary and physiological controls on the hydrogen and oxygen isotope ratios of hair from mid-20th century indigenous populations.Am J Phys Anthropol 139：494-504；Chesson LA,Podlesak DW,Erkkila BR,Cerling TE,Ehleringer JR(2010) Isotopic consequences of consumer food choice：Hydrogen and oxygen stable isotope ratios in foods from fast food restaurants versus supermarkets.Food Chemistry 119：1250-1256)。
    水樣. 將3 ml人類血漿樣品儲存於15 ml法爾康管(falcon tube)中。隨後將管置放於具有15 g CaCl2顆粒(Sigma-Aldrich)之預乾燥且抽真空之圓瓶燒瓶中。隨後將圓瓶燒瓶封蓋且小心地密封以確保空氣中之水不會進入燒瓶中。在室溫下保溫燒瓶以使CaCl2自人類血漿樣品中吸收水，持續七天。藉由真空蒸餾自水合CaCl2獲得水樣(約2 ml)(Buchi Glass Oven B-585,Kugelrohr)。
    測定人類血漿中之氫(δ 2 H)及氧(δ 18 O). 如下進行水樣中之氫(δ2H)及氧(δ18O)之評估。藉由熟知CO2-H2O平衡方法來分析穩定氧同位素組成(Epstein S,Mayeda T(1953)Variation of O18 content of waters from natural sources. Geochimica et Cosmochimica Acta 4：213-224；Brenninkmeijer CAM,Morrison PD(1987)An automated system for isotopic equilibration of CO2 and H2O for 18O analysis of water.Chemical Geology：Isotope Geoscience section 66：21-26)。由VG SIRA 10同位素比質譜儀量測平衡之CO2氣體。在使用由印地安那大學(Indiana University)生物地球化學實驗室製造之鋅珠將水還原成H2之後於VG MM602D同位素比質譜儀上測定氫同位素組成(Coleman ML,Shepherd TJ,Durham JJ,Rouse JE,Moore GR(1982)Reduction of water with zinc for hydrogen isotope analysis.Analytical Chemistry 54：993-995)。所有同位素比結果以相對於國際V-SMOW(維也納標準平均海洋水(Vienna Standard Mean Ocean Water))標準之δ表示法()報導且按SLAP(標準輕南極降水(Standard Light Antarctic Precipitation))之δ18O及δ2H分別為-55.5及-428之標度進行校正(Gonfiantini R(1978)Standards for stable isotope measurements in natural compounds.Nature 271：534-536)。針對實驗室標準表示為1σ之分析精確度分別優於1.3(對於δ2H)及0.08(對於δ18O)。水樣之雙重複分析的平均差異分別為±1.5(對於δ2H)及±0.11(對於δ18O)。
    數據分析. 藉由使用STASTISTICA 8.0(StartSoft.Inc.,Tulsa,OK)進行ANOVA及史都登氏t檢驗(Student's t-test)。在MATLAB R2011a(MathWorks.Inc.,Natick,MA)中進行k平均值叢聚，其將數據分配成四個叢集之預設集(preset)。量測歐幾里德距離(Euclidean distance)以計算叢集之矩心，亦即彼叢集內數據點之平均值。進行總共10,000次重複叢聚過程，在各輪中給出初始叢集矩心位置之新集合。此程序傳回四個叢集之最佳解答方案，其中各叢集之點-矩心距離之總和具有最低值。 實例1 使用本發明方法診斷腎臟失調
    量測來自42個人類血漿之水樣的氫(δ2H)及氧(δ18O)之穩定同位素比。自以下四組參與者隨機獲得樣品：空腹對照個體(CS，n=5)、未經血液透析處理之空腹末期腎臟失調個體(ESRDnHD，n=5)、經血液透析處理之空腹末期腎臟失調個體(ESRDHD，n=5)及空腹糖尿病個體(DB，n=5)。
    對照個體組(CS).
    如表1中所示，CS之δ2H及δ18O之平均值為-4.76及-35.2。
    c.血尿素氮(BUN)測試用以藉由量測血液中呈尿素形式之氮的量來評估腎臟功能。血液中尿素之正常含量為7-20 mg/dL。
    d.肌酐為肌酸之代謝物。使用肌酐測試作為腎臟功能之指示物。血液中肌酐之正常含量對於男性為0.7-1.2 mg/dL，且對於女性為0.5-1.9 mg/dL[45]。
    e.估算腎小球濾過率，腎臟功能之指標。基於MDRD(腎臟失調中之膳食修正)公式eGFR=186×血清肌酐-1154×年齡-0.203×(1.212(若為黑人))×(0.742(若為女性))計算eGFR值[46]。
    f.比率以相對於國際V-SMOW(維也納標準平均海洋水)標準之δ表示法()報導且按SLAP(標準輕南極降水)之δ18O及δ2H分別為-55.5及-428之標度進行校正[44]。
    i.圓括號中之數字為取各組所有數字而得之標準差。
    末期腎臟失調組(ESRD).
    δ2H及δ18O之平均值對於ESRDnHD為-11.89及-72.44，且對於ESRDHD為-10.37及-59.10(表2)。ESRDHD(標準差對於δ18O為2.9且對於δ2H為11.54)相比ESRDnHD(標準差對於δ18O為0.9且對於δ2H為4.9)較分散。就δ2H而言，ESRDHD與ESRDnHD之間的差異顯著[t0.05；30=2.5且F0.05；1,30=6.33]。然而，對於δ18O，差異不顯著[t0.05；30=1.17且F0.05；1,30=1.37]。

    糖尿病組(DB)
    在DB組中，血漿中δ2H之平均值為-4.04，且δ18O之平均值為-34.08(表3)。
    ESRD之水δ 18O及δ 2H值明顯低於CS之δ 18O及δ 2H值。
    ESRDnHD之血漿中之水δ18O及δ2H之值顯示與CS之δ18O及δ2H之值不同的特徵。藉由將史都登氏t檢驗及ANOVA統計分析應用於ESRDnHD及CS數據集，ESRDnHD及CS中之血漿之水含量(δ18O及δ2H)顯示顯著差異[對於δ18O，t0.05；8=13.78且F0．05；1,8=189.83；對於δ2H，t0.05；8=15.08且F0.05；1,8=227.47]。ESRDHD之血漿中之δ18O及δ2H之分佈分散於CS與ESRDnHD之間。ESRDHD之血漿水中之δ18O及δ2H亦顯著低於CS之δ18O及δ2H。ESRD(包括ESRDnHD及ESRDHD)之血漿中之δ18O及δ2H比CS低87%及72%，且比DB低160%及92%。因此，在本研究中血漿中之δ18O及δ2H之值與腎臟功能相關聯。ESRD患者之血漿中之水18O及2H之較低含量令人感興趣，此係因為正常對照個體與腎臟患者共用相同來源之飲用水及膳食水。
    似乎在具有腎臟功能障礙之患者中2H及18O同位素自血漿水中選擇性地「移除」。腎臟之許多功能之一為水的再吸收，現已知其至少部分由不同類型之腎臟水通道蛋白(aquaporin，AQP)(一種形成水通道之質膜蛋白)介導(Nielsen S,Frokiaer J,Marples D,Kwon TH,Agre P等人(2002)Aquaporins in the kidney：from molecules to medicine.Physiological Reviews 82：205-244；King LS,Kozono D,Agre P(2004)From structure to disease：The evolving tale of aquaporin biology.Nature Reviews Molecular Cell Biology 5：687-698；Borgnia M,Nielsen S,Engel A,Agre P(1999)Cellular and molecular biology of the aquaporin water channels.Annual Review of Biochemistry 68：425-458)。舉例而言，水通道蛋白1(AQP1)位於近端小管及增加透水性之下降細支處(Nielsen S,Smith BL,Christensen EI,Knepper MA,Agre P(1993)CHIP28 water channels are localized in constitutively water-permeable segments of the nephron.The Journal of cell biology 120：371-383)。AQP2、AQP3及AQP4位於集合管處，其中AQP2為集合管處透水性之升壓素調控標靶(Nielsen S,Knepper MA(1993)Vasopressin activates collecting duct urea transporters and water channels by distinct physical processes.The American journal of physiology 265：F204-213)。自然地產生如下問題：此等水通道蛋白是否涉及腎臟功能障礙患者之血漿中之18O及2H的較低含量。在先前研究中，原型AQP1之分子動力學(MD)模擬及溶液實驗顯示2H2O之滲透性類似於水之滲透性(Mamonov AB,Coalson RD,Zeidel ML,Mathai JC(2007)Water and deuterium oxide permeability through aquaporin 1：MD predictions and experimental verification.The Journal of general physiology 130：111-116)，而另一研究顯示AQP1之芳族物/精胺酸區域中之點突變使得質子可通過其(Beitz E,Wu B,Holm LM,Schultz JE,Zeuthen T(2006)Point mutations in the aromatic/arginine region in aquaporin 1 allow passage of urea,glycerol,ammonia,and protons.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103：269-274)。此外，在ESRD患者中，發現升壓素之濃度較高(Argent NB,Baylis PH,Wilkinson R(1990)Immunoreactive vasopressin in end stage renal failure.Clinica chimica acta；international journal of clinical chemistry 190：185-188)。升壓素及水分剝奪伴隨腎臟集合管中之AQP2上調(Terris J,Ecelbarger CA,Nielsen S,Knepper MA(1996)Long-term regulation of four renal aquaporins in rats.The American journal of physiology 271：F414-422；Combet S,Gouraud S,Gobin R,Berthonaud V,Geelen G等人(2008)Aquaporin-2 downregulation in kidney medulla of aging rats is posttranscriptional and is abolished by water deprivation.American Journal of Physiology-Renal Physiology 294：F1408-F1414)，且老齡化過程中AQP2之下調為轉錄後的(Combet S,Gouraud S,Gobin R,Berthonaud V,Geelen G等人(2008)Aquaporin-2 downregulation in kidney medulla of aging rats is posttranscriptional and is abolished by water deprivation.American Journal of Physiology-Renal Physiology 294：F1408-F1414)。對ESRDHD之血漿中之單價離子(諸如Na+、K+及Cl-)之含量的進一步研究揭示，亨利氏環(loop of Henle)之上升支之主動輸送的正常功能化(表2)，而腎元之此部分不含水通道蛋白(Nielsen S,Frokiaer J,Marples D,Kwon TH,Agre P等人(2002)Aquaporins in the kidney：from molecules to medicine.Physiological Reviews 82：205-244；King LS,Kozono D,Agre P(2004)From structure to disease：The evolving tale of aquaporin biology.Nature Reviews Molecular Cell Biology 5：687-698)。因此，在系統解析度與原子解析度下研究ESRD之水通道蛋白在穩定同位素中之生理作用可闡明腎臟功能障礙患者中之低重水。
    血漿之 18O及 2H之動態平衡抵抗水源之 18O及 2H含量之波動。
    降雨之δ2H及δ18O值季節性地波動。因為血漿中之大部分水2H及18O最終將來自降雨-飲用水及膳食水之來源，所以令人感興趣的是檢查雨水與血漿水中之δ2H及δ18O值之間的關係。
    比較數據之δ2H及δ18O值與臺北自2000年至2010年每月降水之δ2H及δ18O值(Peng T-R,Wang C-H,Huang C-C,Fei L-Y,Chen C-TA等人(2010)Stable isotopic characteristic of Taiwan's precipitation：A case study of western Pacific monsoon region.Earth and Planetary Science Letters 289：357-366)。1月至5月，雨水之δ2H及δ18O值顯示極小變化。此等值在6月開始下降，在7月及8月達至最小，且自9月至12月回升。另一方面，CS組中之血漿水同位素比始終低於1月至5月之降雨之同位素比。然而，血漿水之同位素比在7月至12月之降雨之標準誤差內。因此，觀測到CS組之血漿中之同位素δ2H及δ18O的動態平衡對抗每日攝入水之波動。
    歸因於7月臺灣常見之颱風，降雨之同位素含量最小，但在所有其他月份中變化極大。7月及3月之ESRDHD之血漿水的同位素比顯著低於降水之同位素比，再次表明雨水之較強獨立性。雖然9月之降水的同位素比接近於CS之同位素比，但在ESRDnHD中仍觀測到相同樣式，比降水之同位素比低約35%。對於DB組，血漿水之δ18O可與12月之降雨之δ18O相當[t0.05；14=0.27且F0.05；1,14=0.07]，但血漿水之δ2H顯示降雨之獨立性[t0.05；14=3.03且F0.05；1,14=9.21]。
    DB及CS組中之水δ 18O及δ 2H值類似。
    來自DB之δ18O及δ2H之值類似於CS之δ18O及δ2H之值。ANOVA分析表明DB及CS之血漿水含量(δ18O及δ2H)相當[對於δ18O，F0.05；1,8=4.63；對於δ2H，F0.05；1,8=0.20]。
    似乎存在反映差異性腎臟狀況之水同位素之生物動態平衡的微調。舉例而言，ESRDnHD及正常腎臟組(CS及DB)具有不同動態平衡水準。應注意，具有正常腎臟功能之三組(表1及表3)，CS及DB之δ18O及δ2H含量類似。另外，吾人注意到，CS個體之年齡(範圍自27至67歲)獨立於DB及ESRD個體(p=0)。ESRDHD組中18O及2H動態平衡之缺乏可歸因於各血液透析之時間及持續時間以及不同ESRDHD個體之水合狀態(Konings CJ,Kooman JP,Schonck M,Cox-Reijven PL,van Kreel B等人(2002)Assessment of fluid status in peritoneal dialysis patients.Perit Dial Int 22：683-692)。
    腎臟功能障礙之原因通常極其複雜，包括藥物、糖尿病、高血壓、敗血症、個人生活方式等等。儘管如此，腎臟受損引起代謝物積聚，其導致2H替代1H且18O替代16O。此最終導致血漿之低同位素。在本研究中，吾人表明腎臟功能障礙與人類血漿中大大減小之δ18O及δ2H相關。觀測到血漿之低同位素之特性在腎臟功能障礙患者中顯現，但在健康個人或糖尿病患者中不會顯現。數據及結果表明，血漿之δ18O及δ2H對腎臟功能敏感但似乎對年齡、種族及膳食不敏感，此可能歸因於生物同位素動態平衡。總之，此初步研究連同生物數據一起表明使用血漿中之δ18O及δ2H之含量作為腎臟功能障礙之潛在標記的可能性。
    权利要求:
    Claims (14)
    [1] 一種在疑似腎臟疾病或腫瘤疾病的個體診斷腎臟疾病或腫瘤疾病可能性的方法，包括測定疑似腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的生物樣品中delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的值，比較該測定的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)值與沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的參考值，基於該測定的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)值與delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的參考值的比較診斷腎臟疾病或腫瘤疾病的可能性；其中當疑似腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的生物樣品中delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的值低於沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的參考值時，則診斷為有腎臟疾病或腫瘤疾病的可能性。
    [2] 如請求項1之方法，其中該得自沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta O-18(δ18O)參考值範圍為-3.0至-4.5。
    [3] 如請求項1之方法，其中該得自沒有腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的delta H-2(δ2H)參考值範圍為-30至-35。
    [4] 如請求項1之方法，其中該腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的生物樣品中delta O-18(δ18O)低於約-5。
    [5] 如請求項1之方法，其中該腎臟疾病或腫瘤疾病的個體的生物樣品中delta H-2(δ2H)低於約-40。
    [6] 如請求項1之方法，其中該生物樣品為體液。
    [7] 如請求項6之方法，其中該體液為尿液、血液、血清、血漿、唾液、淋巴液、腦脊髓液、囊性液(cystic fluid)、腹水、糞便、膽汁或組織液。
    [8] 如請求項6之方法，其中該體液為血漿。
    [9] 如請求項1之方法，其中該生物樣品之處理係將該樣品置於含乾燥劑的密閉容器，並接著從含水(或水合)的乾燥劑去除水分以得到用於測定delta O-18(δ18O)和/或delta H-2(δ2H)的值的水，或該生物樣品經逆滲透處理得到該水。
    [10] 如請求項9之方法，其中自含水(或水合)乾燥劑去除水係經蒸餾或真空蒸餾。
    [11] 如請求項1之方法，其中該腎臟疾病為末期腎失調、腎病變、腎衰竭、高尿酸血症、糖尿病性腎病變、缺血性或毒物誘導的腎傷害、慢性腎衰竭、急性腎衰竭、腎小球性腎炎、多囊性腎病或慢性腎盂腎炎。
    [12] 一種套組，其包括一包含生物樣品的容器或預定充填該樣品的容器，該生物樣品得自可能罹患腎臟疾病或腫瘤疾病的個體或罹患腎臟疾病或腫瘤疾病風險的個體，一測定生物樣品中delta O-18和/或delta H-2的裝置，和一參考值裝置，用於診斷腎臟疾病或腫瘤疾病。
    [13] 如請求項12之套組，其另包含含有乾燥劑的容器。
    [14] 如請求項12之套組，其中該乾燥劑係選自矽膠(silica gel)、活性碳、硫酸鈣、氯化鈣、蒙脫黏土(montmorillonite clay)和分子篩(molecular sieve)之群組。
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